 |
اولین رشته CDNA سنتز کیت R1011/R1012 Reverse Transcriptase PCR Reagents
جزئیات محصول:
| محل منبع: | چین |
| نام تجاری: | GDSBio |
| گواهی: | / |
| شماره مدل: | R1011/R1012 |
پرداخت:
| مقدار حداقل تعداد سفارش: | 1 جعبه |
|---|---|
| جزئیات بسته بندی: | بسته بندی کوچک یا توزیع فله یا OEM |
| زمان تحویل: | 8 روز کاری |
| شرایط پرداخت: | L/C، D/A، D/P، T/T، Western Union، MoneyGram |
| قابلیت ارائه: | 100 جعبه / جعبه در روز |
|
اطلاعات تکمیلی |
|||
| گربه خیر: | R1011/R1012 | تمرکز: | R1011 (20 rxns)، R1012 (100 rxns) |
|---|---|---|---|
| ظاهر: | بی رنگ | گروه: | معرف های PCR ترانس کریپتاز معکوس |
| فعالیت: | عبور | قابلیت تقویت: | / |
| چاپ لوگو: | با چاپ لوگو | بسته حمل و نقل: | بسته بندی |
| ظرفیت تولید: | 100 جعبه / جعبه در روز | شرایط نگهداری: | در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شود |
| برجسته: | 20 rxns Reverse Transcriptase PCR Reagents,100 rxns Reverse Transcriptase PCR Reagents,20 rxns اولین رشته سنتز cdna |
||
توضیحات محصول
کیت RT - PCR
فقط برای استفاده تحقیقاتی
گربه شماره R1011، 20 rxns
گربه شماره R1012، 100 rxns
اجزای کیت
| جزء | R1011 (20 rxns) | R1012 (100 rxns) |
| M-MLV (200U/μl) | 20 میکرولیتر | 100 میکرولیتر |
| RNasin (40U/μl) | 12 میکرولیتر | 60 میکرولیتر |
| الیگو(dT)15(50μM) | 20 میکرولیتر | 100 میکرولیتر |
| پرایمر هگزامر تصادفی (50μM) | 20 میکرولیتر | 100 میکرولیتر |
| 5× بافر رشته اول | 80 میکرولیتر | 400 میکرولیتر |
| ddH بدون RNase2O | 1 میلی لیتر | 1 میلی لیتر × 5 |
| dNTP (هر کدام 10 میلی‌مولار) | 50 میکرولیتر | 250 میکرولیتر |
ذخیره سازی
تمام اجزای کیت باید در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شوند.RNA کنترل را در دمای -70 درجه سانتیگراد برای نگهداری طولانی تر نگه دارید.
دیشرح
کیت RT-PCR برای سنتز cDNA رشته اول از پلی(A)+ یا RNA کل خالص شده بهینه شده است.کیت RT-PCR برای RT-PCR افزایش بازده cDNA، حساسیت بالا و رونوشت های تمام طول را در قالبی مناسب ارائه می دهد.شما تمام اجزای مورد نیاز برای سنتز موفق cDNA رشته اول را دریافت می‌کنید که در زمان شما صرفه‌جویی می‌کند و موفقیت شما را در هر آزمایش تضمین می‌کند.کیت Reverse Transcriptase نسخه ای از M-MLV RT است که برای کاهش فعالیت RNase H و افزایش پایداری حرارتی مهندسی شده است.این آنزیم برای سنتز cDNA در محدوده دمایی 42 تا 55 درجه سانتیگراد استفاده می شود که ویژگی افزایش یافته، بازده بالاتر cDNA و محصول کامل تری را نسبت به سایر ترانس کریپتازهای معکوس ارائه می دهد.
برنامه های کاربردی
سنتز cDNA رشته اول برای RT-PCR
ساخت کتابخانه های cDNA
RT-PCR یک مرحله ای
پسوند پرایمر
منیادداشت های مهم
جلوگیری از آلودگی ریبونوکلئاز
خلوص و یکپارچگی RNA برای سنتز cDNA تمام قد ضروری است.RNA می تواند توسط RNase A تجزیه شود، که یک آلاینده بسیار پایدار است که در هر محیط آزمایشگاهی یافت می شود.تمام اجزای کیت برای اطمینان از اینکه فاقد RNase هستند، به شدت آزمایش شده اند.برای جلوگیری از آلودگی محیط آزمایشگاه و معرف ها، همه محلول های آماده شده باید عاری از RNase باشند.توصیه های عمومی برای جلوگیری از آلودگی RNase:
- تمام لوله‌ها و نوک پیپت‌ها را برای استفاده در سنتز cDNA درمان کنید یا از آزمایشگاه‌های تایید شده فاقد هسته استفاده کنید.
- هنگام کار با RNA و همه معرف ها از دستکش استفاده کنید، زیرا پوست منبع رایج RNase ها است.دستکش ها را مرتب عوض کنید.
- از معرف های بدون RNase، از جمله آب با کیفیت بالا (به عنوان مثال، آب تصفیه شده با DEPC) استفاده کنید.
- از یک مهارکننده RNase مانند Dongsheng RNasin (#R2011) برای محافظت از RNA در برابر فعالیت RNaseها استفاده کنید.
- تمام اجزای کیت را در صورت عدم استفاده، محکم بسته نگه دارید.در طول واکنش رونویسی معکوس، تمام لوله ها را محکم بسته نگه دارید.
الگوی RNA
RNA سلولی کل جدا شده با روش های استاندارد برای استفاده با کیت مناسب است.RNA خالص شده باید عاری از نمک، یون فلز، اتانول و فنل باشد تا از مهار واکنش سنتز cDNA جلوگیری شود.آلاینده های کمیاب را می توان با رسوب اتانولی RNA و سپس دو بار شستشوی پلت با اتانول سرد 75 درصد حذف کرد.برای کاربردهای RT-PCR، RNA الگو باید عاری از آلودگی DNA باشد.قبل از سنتز cDNA، RNA را می توان با DNase I درمان کرد تا مقادیر کمی از DNA حذف شود.DNase I باید توسط کاربر بدست آید.همیشه یک واکنش کنترلی (RT-minus) انجام دهید که شامل تمام اجزای RT-PCR به جز آنزیم ترانس کریپتاز معکوس است.
هضم RNase H
حساسیت مرحله PCR را می توان با حذف الگوی RNA از مولکول هیبریدی cDNA:RNA با هضم با RNase H پس از سنتز رشته اول افزایش داد (مخصوصاً برای الگوهای بلند).وجود RNase H در طول سنتز رشته اول، mRNA الگو را تخریب می‌کند و منجر به کاهش سنتز cDNA تمام طول و کاهش بازده cDNA رشته اول می‌شود.
آغازگرها
سنتز cDNA رشته اول را می توان با پرایمر oligo(dT)15، پرایمرهای تصادفی یا پرایمرهای اختصاصی ژن پرایم کرد.
Oligo(dT)15 سنتز cDNA را از دم پلی (A) موجود در انتهای 3' mRNA یوکاریوتی آغاز می کند.پرایمرهای تصادفی سنتز cDNA را از کل جمعیت RNA (rRNA و mRNA) آغاز می کنند.بنابراین، استفاده از پرایمرهای تصادفی برای سنتز رشته اول منجر به پیچیدگی بیشتر cDNA تولید شده در مقایسه با پرایمر oligo(dT)15 می شود.در نتیجه، حساسیت و ویژگی واکنش‌های PCR بعدی ممکن است کاهش یابد.با این حال، کاربردهای متعددی وجود دارد که در آنها استفاده از پرایمرهای تصادفی مفید است، مانند سنتز cDNA با استفاده از mRNA بدون دم پلی (A) یا سنتز cDNA با استفاده از نمونه‌های RNA غنی شده با پلی (A).
پرایمرهای اختصاصی ژن برای سنتز cDNA خاص از مخزن RNA یا mRNA کل استفاده می شود و باید توسط کاربر تهیه شود.
اولین- اسروند سنتز cDNA
واکنش cDNA رشته اول را می توان به صورت یک واکنش فردی یا به صورت مجموعه ای از واکنش های موازی با الگوهای مختلف RNA انجام داد.بنابراین، مخلوط واکنش را می توان با ترکیب معرف ها به صورت جداگانه تهیه کرد یا یک مخلوط اصلی حاوی همه اجزا به جز RNA الگو تهیه کرد.بسته به ساختار الگوی RNA، مراحل جداگانه برای دناتوراسیون RNA و بازپخت پرایمر ممکن است نتایج RT-PCR را بهبود بخشد.
پروتوکل
من.سنتز cDNA رشته اول
1. معرف های زیر را به ترتیب مشخص شده در یک لوله استریل و بدون هسته روی یخ اضافه کنید:
| الگوی RNA |
mRNA پلی (A). یا RNA خاص |
1-5 میکروگرم |
| آغازگر |
الیگو (dT)15آغازگر یا پرایمر هگزامر تصادفی |
1 میکرولیتر 1 میکرولیتر |
| آب تصفیه شده با DEPC | تا 12.4 میکرولیتر | |
| حجم کل | 12.4 میکرولیتر | |
2. به آرامی مخلوط کنید، برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید و در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه انکوبه کنید.روی یخ بگذارید، بچرخانید و ویال را روی یخ قرار دهید.
3. مخلوط سنتز cDNA زیر را آماده کنید، اجزای زیر را به ترتیب مشخص شده اضافه کنید:
| بافر 5× رشته اول | 4 میکرولیتر |
| dNTP (هر کدام 10 میلی‌مولار) | 1 میکرولیتر |
| RNasin | 0.6 میکرولیتر |
| M-MLV | 1 میکرولیتر |
4. به آرامی مخلوط کنید و برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید.
5. برای oligo(dT)15به مدت 60 دقیقه در دمای 42 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.برای سنتز پرایم شده تصادفی هگزامر، به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه کنید.
6. واکنش را با حرارت دادن در 70 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه خاتمه دهید.
محصول واکنش رونویسی معکوس را می توان بلافاصله در واکنش های سنتز cDNA رشته دوم استفاده کرد یا در دمای 20- درجه سانتی گراد برای کمتر از یک هفته نگهداری کرد.برای نگهداری طولانی تر، -70 درجه سانتیگراد توصیه می شود.
II.PCR تقویت cDNA رشته اول
محصول سنتز cDNA رشته اول را می توان مستقیماً در PCR یا qPCR استفاده کرد.حجم مخلوط واکنش سنتز cDNA رشته اول نباید بیش از 1/10 از کل حجم واکنش PCR باشد.به طور معمول، 2 میکرولیتر از مخلوط واکنش سنتز cDNA رشته اول به عنوان الگو برای PCR بعدی در حجم کل 50 میکرولیتر استفاده می شود.
Dongsheng Biotech سری های مختلفی از محصولات را برای کمک به شما در دستیابی به موفقیت PCR ارائه می دهد.برای آنزیم ها، Taq Polymerase، HS Taq DNA Polymerase، FS Taq DNA Polymerase، Pfu DNA Polymerase و Fusion Pfu DNA Polymerase عملکرد PCR با دقت بالا، کارآمد و با حساسیت را ارائه می دهند.ما همچنین Long Taq DNA Polymerase برای عملکرد طولانی PCR داریم.
